Beinmargstransplantasjon og graft-vs-host disease (GvHD)
Graft-versus-host disease (GvHD) er en komplikasjon som forekommer i omtrent 50 % av pasienter som mottar transplantasjon av hematopoietiske stamceller ifm behandling av blodkreft, og er en dødelig sykdom hvor donors T-celler går til angrep på pasientens friske vev. Vi har en veletablert rottemodell for akutt GvHD, som vi vil benytte for å 1) finne nye biomarkører som kan forutsi utvikling av akutt GvHD, og 2) hvilken rolle NK-celler og "innate lymphoid cells" spiller i utvikling av akutt GvHD, og 3) teste om NK-celler og/eller "innate lymphoid cells" kan benyttes som celleterapi for å bremse eller forhindre utvikling av GvHD.
Vi søker om å få benytte totalt 300 dyr over en 4-årsperiode (75 dyr/år). Rotter helkroppssbestråles fra en X-ray kilde, og transplanteres med beinmargsceller fra MHC-uforlikelige donorrotter (allogen beinmargstransplantasjon). Beinmargen depleteres for T-celler før transplantasjon. Rottene blir injisert med donor T-celler 14 dager etter beinmargstransplantasjon, og utvikler akutt GvHD etter ytterligere 12-14 dager. Dyrene avlives og ulike organer (lymfeknuter, milt, beinmarg, tarm, lever, lunger, hud, blod) isoleres ut for å teste ulike parametre (celleoverflatereseptorer, cytokiner, cytokinreseptorer, screening av mRNA og miRNA, funksjonelle tester av celler). Vi benytter MHC-kongene rottestammer slik at effekten av MHC-uforlikelighet alene kan studeres. .
For celleterapi, vil dyrene bli injisert med terapeutiske celler som en preventiv behandling, som vil starte samtidig med at T-celler blir injisert, og videre med 2-3 dagers mellomrom. Formålet er å studere om disse cellepopulasjonene kan bremse sykdomsutviklingen. NK-celler og "innate lymphoid cells" isoleres fra friske rotter som vi avler selv (se søknad ID15044 og ID15045), og settes i korttidskultur før de injiseres intravenøst. Effekten vil bli sammenlignet mot en kontrollgruppe som mottar transplantat fra en MHC-identisk donor, og som ikke utvikler akutt GvHD.
Ulike typer immunceller (T-celler, NK-celler, B-celler og muligens "innate lymphoid cells") både i transplantatet og i mottageren bidrar i ulik grad til det kliniske forløpet av denne sykdommen. Slike kompliserte interaksjoner og fysiologi kan ikke reproduseres i et reagensrør, og ingen in vitro test kan erstatte de observasjonene vi gjør i forsøksdyr. Vi ønsker derfor å gjøre in vivo eksperimenter som beskrevet i denne søknaden, for å bedre kunne studere denne kompliserte sykdommen. Vår ekspertise i modellen, samt at å planlegge eksperimentene godt, vil kunne holde antall dyr som benyttes i forsøk til et minimum. Dyr i forsøk følges nøye vha et klinisk skåringsskjema som avgjør når dyr skal avlives, og om de skal få smertestillende eller bløtfor. Vi ønsker å bytte anestesilegemiddel fra Hypnorm til ZRF-cocktail. Hypnorm produseres ikke lengre, og er dermed ikke lengre mulig å få tak i på markedet. Vi har dermed behov for et alternativt anestesimiddel.Endringen gjelder kun bytte til et anestesimiddel som det allerede eksisterer erfaring med ifm rotter. Endret anestesi har den samme kvalitative effekten på dyrevelferden som beskrevet i søknaden.
Vi søker om å få benytte totalt 300 dyr over en 4-årsperiode (75 dyr/år). Rotter helkroppssbestråles fra en X-ray kilde, og transplanteres med beinmargsceller fra MHC-uforlikelige donorrotter (allogen beinmargstransplantasjon). Beinmargen depleteres for T-celler før transplantasjon. Rottene blir injisert med donor T-celler 14 dager etter beinmargstransplantasjon, og utvikler akutt GvHD etter ytterligere 12-14 dager. Dyrene avlives og ulike organer (lymfeknuter, milt, beinmarg, tarm, lever, lunger, hud, blod) isoleres ut for å teste ulike parametre (celleoverflatereseptorer, cytokiner, cytokinreseptorer, screening av mRNA og miRNA, funksjonelle tester av celler). Vi benytter MHC-kongene rottestammer slik at effekten av MHC-uforlikelighet alene kan studeres. .
For celleterapi, vil dyrene bli injisert med terapeutiske celler som en preventiv behandling, som vil starte samtidig med at T-celler blir injisert, og videre med 2-3 dagers mellomrom. Formålet er å studere om disse cellepopulasjonene kan bremse sykdomsutviklingen. NK-celler og "innate lymphoid cells" isoleres fra friske rotter som vi avler selv (se søknad ID15044 og ID15045), og settes i korttidskultur før de injiseres intravenøst. Effekten vil bli sammenlignet mot en kontrollgruppe som mottar transplantat fra en MHC-identisk donor, og som ikke utvikler akutt GvHD.
Ulike typer immunceller (T-celler, NK-celler, B-celler og muligens "innate lymphoid cells") både i transplantatet og i mottageren bidrar i ulik grad til det kliniske forløpet av denne sykdommen. Slike kompliserte interaksjoner og fysiologi kan ikke reproduseres i et reagensrør, og ingen in vitro test kan erstatte de observasjonene vi gjør i forsøksdyr. Vi ønsker derfor å gjøre in vivo eksperimenter som beskrevet i denne søknaden, for å bedre kunne studere denne kompliserte sykdommen. Vår ekspertise i modellen, samt at å planlegge eksperimentene godt, vil kunne holde antall dyr som benyttes i forsøk til et minimum. Dyr i forsøk følges nøye vha et klinisk skåringsskjema som avgjør når dyr skal avlives, og om de skal få smertestillende eller bløtfor. Vi ønsker å bytte anestesilegemiddel fra Hypnorm til ZRF-cocktail. Hypnorm produseres ikke lengre, og er dermed ikke lengre mulig å få tak i på markedet. Vi har dermed behov for et alternativt anestesimiddel.Endringen gjelder kun bytte til et anestesimiddel som det allerede eksisterer erfaring med ifm rotter. Endret anestesi har den samme kvalitative effekten på dyrevelferden som beskrevet i søknaden.
Etterevaluering
Vi klassifiserer forsøket som betydelig belastende, jf. forsøksdyrforskriften vedlegg B.
Rottene vil utvikle GvHD, med betydelig negativ påvirkning av deres helse og velferd. Forsøket skal etterevalueres, jf. instruks om Mattilsynets forvaltning av forsøksdyrforskriften § 13.
Rottene vil utvikle GvHD, med betydelig negativ påvirkning av deres helse og velferd. Forsøket skal etterevalueres, jf. instruks om Mattilsynets forvaltning av forsøksdyrforskriften § 13.
Begrunnelse for etterevalueringen
Forsøkets formål har vært å finne nye biomarkører som kan forutsi utvikling av akutt transplantat-mot vert sykdom (graft-versus-host disease, GvHD), å undersøke hvilken rolle NK-celler og «innate lymphoid cells» spiller i utviklingen av akutt GvHD, samt å teste om NK-celler og/eller «innate lymphoid cells» kan benyttes i celleterapi for å bremse eller forhindre utvikling av GvHD.
Det ble gitt tillatelse til å bruke 300 rotter over 4 år i forsøk som innebærer helkroppsbestråling, transplantasjon med allogen eller syngen (kontrolldyr) benmarg hvor T-cellene er fjernet, og injeksjon med donor T-celler. Rottene som får allogen benmarg utvikler GvHD.
Det langsiktige målet med forsøket har vært å skaffe mer kunnskap om mekanismene som er involvert ved utvikling av GvHD, som er en vanlig komplikasjon ved stamcelleterapi mot f.eks. blodkreft, og som medfører høy dødelighet.
Forsøksansvarlig angir at de resultatene som var ønsket i forhold til funksjon og fenotyper, samt hvordan donorceller infiltrerer organer over tid, ble oppnådd.
Forskergruppen har funnet at NK-celler og ILC er mer aktivert i vev som kjennetegnes av akutt GvHD, og deres hypotese er at disse cellene bidrar til å øke betennelse og vevsdestruksjon
I forbindelse med forsøkene ble det gjennomført RNA-sekvensering av enkeltceller i tarm fra syke dyr, kontrolldyr, og helt friske dyr. Dette datasettet vil være svært verdifullt for videre studier, og det ser ut til at det er avdekket til nå ukjente grupper av medfødte lymfocytter i tarmvev hos rotter. Disse dataene er fortsatt under analyse.
Resultatene vil bli fulgt opp med nye forsøk, ved bruk av in vitro organoide-modeller for å kunne mekanistisk studere interaksjon mellom NK-celler og ILC i forhold til alloreaktive T-celler.
245 dyr ble brukt totalt.
164 av disse hadde mild belastningsgrad. Dette dreide seg om kontrolldyr som ble benmargstransplantert, men som ikke utviklet GvHD og benmargstransplanterte dyr som ble avlivet før de utviklet kliniske tegn, som en del av tidslinjestudier.
58 dyr havnet i kategori moderat belastning. Disse dyrene utviklet symptomer på GvHD (vekttap under 10 %, noe såre øyne, noe lavere aktivitet). 14 dyr ble kategorisert som "severe" alvorlighetsgrad, og var dyr som ble avlivet grunnet mer enn 10 % vekttap.
Forskergruppen fant at om dyrene utviklet alvorlig akutt GvHD var det vanskeligere å hente ut viable celler fra vev. Derved kunne belastningsgraden for dyrene reduseres tidlig i prosjektet. Dyrene ble avlivet med en gang de første kliniske sykdomstegnene oppsto.
Scoringsskjemaet ble aktivt brukt, og var til stor hjelp for å evaluere belastningsgraden av dyrene.
Underveis i dette prosjektet fantes det ingen alternativer til en dyremodell, da GvHD er en multi-organsykdom som er vanskelig å reprodusere in vitro.
Det er nå flere organoide-plattformer under utvikling, som i fremtiden kan tas i bruk for å redusere noen av forsøkene som før bare kunne gjøres in vivo.
Forsøksansvarlig angir at det kunne være ønskelig med noen flere eksperimentelle oppsett, men blant annet Covid gjorde at det ikke ble satt opp så mange del-forsøk som planlagt.
Forsøksansvarlig angir at det ville være vanskelig å redusere antall dyr ut fra opprinnelig forsøksdesign, da et minimum antall dyr er nødvendig i hver eksperimentelle serie. Under dette prosjektet var forsøksmedarbeiderne nøye med å evaluere og sammenstille data kontinuerlig, for å begrense antall forsøk som måtte gjøres til et minimum.
Det er brukt tilstrekkelig antall dyr i forsøket for statistisk analyse, men det ville være en fordel med bruk av flere forsøksdyr for enda sterkere signifikans.
Det ble gitt tillatelse til å bruke 300 rotter over 4 år i forsøk som innebærer helkroppsbestråling, transplantasjon med allogen eller syngen (kontrolldyr) benmarg hvor T-cellene er fjernet, og injeksjon med donor T-celler. Rottene som får allogen benmarg utvikler GvHD.
Det langsiktige målet med forsøket har vært å skaffe mer kunnskap om mekanismene som er involvert ved utvikling av GvHD, som er en vanlig komplikasjon ved stamcelleterapi mot f.eks. blodkreft, og som medfører høy dødelighet.
Forsøksansvarlig angir at de resultatene som var ønsket i forhold til funksjon og fenotyper, samt hvordan donorceller infiltrerer organer over tid, ble oppnådd.
Forskergruppen har funnet at NK-celler og ILC er mer aktivert i vev som kjennetegnes av akutt GvHD, og deres hypotese er at disse cellene bidrar til å øke betennelse og vevsdestruksjon
I forbindelse med forsøkene ble det gjennomført RNA-sekvensering av enkeltceller i tarm fra syke dyr, kontrolldyr, og helt friske dyr. Dette datasettet vil være svært verdifullt for videre studier, og det ser ut til at det er avdekket til nå ukjente grupper av medfødte lymfocytter i tarmvev hos rotter. Disse dataene er fortsatt under analyse.
Resultatene vil bli fulgt opp med nye forsøk, ved bruk av in vitro organoide-modeller for å kunne mekanistisk studere interaksjon mellom NK-celler og ILC i forhold til alloreaktive T-celler.
245 dyr ble brukt totalt.
164 av disse hadde mild belastningsgrad. Dette dreide seg om kontrolldyr som ble benmargstransplantert, men som ikke utviklet GvHD og benmargstransplanterte dyr som ble avlivet før de utviklet kliniske tegn, som en del av tidslinjestudier.
58 dyr havnet i kategori moderat belastning. Disse dyrene utviklet symptomer på GvHD (vekttap under 10 %, noe såre øyne, noe lavere aktivitet). 14 dyr ble kategorisert som "severe" alvorlighetsgrad, og var dyr som ble avlivet grunnet mer enn 10 % vekttap.
Forskergruppen fant at om dyrene utviklet alvorlig akutt GvHD var det vanskeligere å hente ut viable celler fra vev. Derved kunne belastningsgraden for dyrene reduseres tidlig i prosjektet. Dyrene ble avlivet med en gang de første kliniske sykdomstegnene oppsto.
Scoringsskjemaet ble aktivt brukt, og var til stor hjelp for å evaluere belastningsgraden av dyrene.
Underveis i dette prosjektet fantes det ingen alternativer til en dyremodell, da GvHD er en multi-organsykdom som er vanskelig å reprodusere in vitro.
Det er nå flere organoide-plattformer under utvikling, som i fremtiden kan tas i bruk for å redusere noen av forsøkene som før bare kunne gjøres in vivo.
Forsøksansvarlig angir at det kunne være ønskelig med noen flere eksperimentelle oppsett, men blant annet Covid gjorde at det ikke ble satt opp så mange del-forsøk som planlagt.
Forsøksansvarlig angir at det ville være vanskelig å redusere antall dyr ut fra opprinnelig forsøksdesign, da et minimum antall dyr er nødvendig i hver eksperimentelle serie. Under dette prosjektet var forsøksmedarbeiderne nøye med å evaluere og sammenstille data kontinuerlig, for å begrense antall forsøk som måtte gjøres til et minimum.
Det er brukt tilstrekkelig antall dyr i forsøket for statistisk analyse, men det ville være en fordel med bruk av flere forsøksdyr for enda sterkere signifikans.